A los 21 años fue recibido como religioso en la comunidad de Padres Carmelitas, y obtuvo el permiso de observar los reglamentos con toda la exactitud posible sin buscar excepciones en nada. Al ser ordenado sacerdote en 1567, pidió a Dios como especial regalo que lo conservara siempre en gracia y sin pecado y que pudiera sufrir con todo valor y con mucha paciencia toda clase de dolores, penas y enfermedades.
Santa Teresa había fundado la comunidad de las Hermanas Carmelitas Descalzas y deseaba fundar también una comunidad de Padres Carmelitas que se dedicaba a observar los reglamentos con la mayor exactitud posible. Mientras tanto nuestro santo le pedía a Dios que le iluminara un modo de vivir tan fervoroso que lo llevara pronto a la santidad. Y he aquí que al encontrarse los dos santos, descubrió Santa Teresa que este era el indicado para empezar su nueva comunidad y con otros dos frailes fundó su nueva comunidad de Carmelitas descalzos. Los envió a vivir a un convento muy pobre, llamado Duruelo.
Al fundar su nuevo convento en Salamanca, fue nombrado como rector Fray Juan de la Cruz, dedicándose con todas sus fuerzas al apostolado.
Dios le había concedido una cualidad especial: la de saber enseñar el método para llegar a la santidad. Y eso que enseñaba de palabra a personas que dirigía, lo fue escribiendo y resultaron unos libros tan importantes que le han conseguido que el Sumo Pontífice lo haya declarado Doctor de la Iglesia. Algunos de sus libros más famosos son: «La subida del Monte Carmelo», y «La noche oscura del alma».
Como poeta ha sido admirado por siglos a causa de la musicalidad de sus poesías y de la belleza de sus versos. Es muy popular su «Cántico Espiritual».
Después de tres meses de sufrimientos muy agudos, el santo murió el 14 de diciembre del año 1591. Apenas tenía 49 años.
